成熟動物脊髄後根神経節細胞（DRG neuron) の分散培養法とその応用

東京都神経科学総合研究所・発生形態研究部門

三五一憲

kazsango@tmin.ac.jp

神経細胞・組織の初代培養法を用いた研究は、胎生及び新生動物を対象とした発生、分化に関するものが主流であり、成熟動物を対象としたものは少ない。末梢感覚神経細胞である脊髄後根神経節 (dorsal root ganglion (DRG)) ニューロンの分散培養は、成熟動物においても容易であり、神経の可塑性、老化や疾患に伴う神経機能障害等を評価する上で有用な実験系である。我々はこの培養系をストレプトゾトシン (STZ) 糖尿病マウスやG_M2ガングリオシド蓄積症モデルマウスに適用して、代謝異常に伴う神経細胞の接着、生存、神経突起伸長等の変化について検討している。また、成熟ラットDRG培養系を駆使して、神経再生を促進もしくは制御する因子（特に酸化型ガレクチン-1やコンドロイチン硫酸プロテオグリカン）の作用機構を解析している。

今回は、我々の研究室で用いているDRG neuronの培養方法について、試薬、器具等を含めて詳しく紹介するとともに、最近の研究成果・経過の一部を報告する。

成熟マウスDRG neuronの分散培養（概略）

1. 生後8-9週のマウスをエーテルで屠殺後、背側の皮膚を切除し、脊椎（胸部〜腰部）を一塊として切り出す。

2. 吻側から尾側に向けてはさみを入れ、脊柱管を切り開いた後、脊髄を除去する。

3. 実体顕微鏡下にDRGを確認し、ピンセット (Inox No.5) で摘出して、Ham’s F12培養液 (Invitrogen) を満たしたディッシュ (Falcon, 3001) に入れる。

4. 摘出したDRG（15-20個）を実体顕微鏡で観察しながら、神経節に近い部位で線維束を切断して除く。（この処理により、神経細胞の回収率がより高くなる。）

5. 0.2%コラゲナーゼ（Worthington Biochem., Class 3 : 37℃、90分）及び0.25%トリプシン（Sigma : 37℃、15分）による酵素処理の後、トリプシンインヒビター (Sigma: 5drops»150 ml) を加え、先を細くしたパスツールピペットを用いて充分にピペッティングする。

6. 30%パーコール (Pharmacia Biotech.) による密度勾配遠心分離（1,000回転、5分）により、ミエリンや非神経細胞を除く。回収した神経細胞を10%仔牛血清入りのF12培養液で２回洗って、ポリリジン (Sigma) コートしたディッシュに撒布する。

7. 細胞を撒布したディッシュをCO₂インキュベーターに入れ、６〜12時間静置した後、無血清培養液 (F12/B27 (Invitrogen)) をディッシュに加える。培養液は２〜３日毎に交換する。

[参考文献]

1) Scott, B.S. Adult mouse dorsal root ganglia neurons in cell culture. J. Neurobiol., 8:417-427. (1977)

2) Goldenberg, S.S.S., De Boni, U. Pure population of viable neurons from rabbit dorsal root ganglia, using gradients of Percoll. J. Neurobiol., 14, 195-206. (1983)

3) Fukuda, J. Nerve cells of adult and aged mice grown in a monolayer culture: age-associated changes in morphological and physiological properties of dorsal root ganglion cells in vitro. Dev. Neurosci., 7:374-394. (1985)

4) Lindsay, R.M. Nerve growth factors (NGF, BDNF) enhance axonal regeneration but are not required for survival of adult sensory neurons. J. Neurosci., 8:2394-2405. (1988)

5) 金承業、朝長正徳：神経組織培養法、藤田企画出版 (1989)

6) Horie, H., Ikuta, S., Takenaka, T., Membrane elasticity of mouse dorsal root ganglion neurons decreases with aging. FEBS Lett., 269:23-25. (1990)

7) Sango, K., Horie, H., Sotelo, J.R. and Takenaka, T. A high glucose environment improves survival of diabetic neurons in culture. Neurosci. Lett., 129:277-180. (1991)

8) Sango, K., Horie, H., Inoue, S., Takamura, Y. and Takenaka, T. Age-related changes of DRG neuronal attachment to extracellular matrix proteins in vitro. NeuroReport, 4:663-666. (1993)

9) Sango, K., Verdes, J.M., Hikawa, N., Horie, H., Tanaka, S., Inoue, S., Sotelo, J.R. and Takenaka, T. Nerve growth factor (NGF) restores depletions of calcitonin gene-related peptide and substance P in sensory neurons from diabetic mice in vitro. J. Neurol. Sci., 129:1-5. (1994)

10) Horie, H. and Akahori, Y. Three-dimensional cell aggregation enhances growth-promoting activity of NGF in adult DRG. NeuroReport, 6:37-40. (1994)

11) Hikawa, N., Kiuchi, Y., Maruyama, T. and Takenaka, T. Delayed neurite regeneration and its improvement by nerve growth factor (NGF) in dorsal root ganglia from MRL-lpr/lpr mice in vitro. J. Neurol. Sci., 149:13-17. (1997)

12) Davies, S.J., Fitch, M.T., Memberg, S.P., Hall, A.K., Raisman, G. and Silver, J. Regeneration of adult axons in white matter tracts of the central nervous system. Nature, 390: 680-683. (1997)

13) Haynes, L.W. (ed.), The Neuron in Tissue Culture. John Wiley & Sons Ltd., Chichester (1999)

14) Sango, K., Yamanaka, S., Ajiki, K., Tokashiki, A. and Watabe, K. Lysosomal storage results in impaired survival but normal neurite outgrowth in dorsal root ganglion neurons from a mouse model of Sandhoff disease. Neuropathol. Appl. Neurobiol., 28:23-34. (2002)

15) Saito, H., Sango, K., Horie, H., Takeshita, K., Ikeda, H., Ishigatsubo, Y. and Ishikawa, Y. Trachea enhances neurite regeneration from adult rat nodose ganglia in vitro. Life Sci., 70:1935-1946. (2002)

16) Sango, K., Oohira, A., Ajiki, K., Tokashiki, A, Horie, M. and Kawano, H. Phosphacan and neurocan are repulsive substrata for adhesion and neurite extension of adult rat dorsal root ganglion neurons in vitro, Exp. Neurol., 182:1-11. (2003)