第19回神経組織培養研究会　9/6/03

 

シュワン細胞の培養

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　東京都神経科学総合研究所分子神経病理　渡部和彦

 

成体マウス後根神経節からのシュワン細胞の培養

１．成体マウス（我々は4-8週齢を用いている）５匹をエーテル深麻酔により殺す．

２．背部の皮膚をはがした後，脊柱と脊髄を含む後背部組織を採取し10 cmペトリ皿に移してPBSで洗う．

３．腹側から脊柱を切り放し，脊髄を露出させ，ピンセットで脊髄を取り除く．頚髄から仙髄にわたり20対余りの後根神経節が顔を出すので，これらをピンセットで１つずつ取り出し，培養液（5%FBS, ペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM）のはいった6 cmペトリ皿に入れ，付着した血液成分と周囲の結合組織をできるだけ取り除く．

４．後根神経節を5% FBS, 0.125% collagenase (Worthington Biomedical; CLS-1), 40 unit dispase (Collaborative #40235)を含むDMEMに移し，37oCで１時間インキュベートする．

５．反応液を10-15回やさしくピペッティングしたのち，ナイロン・メッシュまたはCell strainer (Falcon #2360)に通して細胞を分散させる．

６．1,000回転5分遠心し，細胞沈殿を培養液5 mlで洗う操作を２回繰り返す．

７．細胞沈殿を培養液5 mlに浮遊させ，あらかじめ培養液を9 mlずつ入れてある10 cm Poly-L-lysine (mol.wt.>300,000, Sigma #P1524) 塗布ペトリ皿5枚に１mlずつ分注し，37oC，5%CO2で培養を開始する．この時点で，浮遊液は大量のミエリン塊を含んでいるので白濁している．一度に大量の培養が必要ない場合は，ミエリン塊を含んだ処理途中の細胞をそのまま凍結保存する (10% dimethylsulfoxide/40% FCS/50%DMEM)．解凍後少なくとも70%程度の生細胞の回収率は期待できる．

８．2日間静置培養後，浮遊しているミエリン塊を培養液で３回洗浄除去する．残った付着細胞を位相差顕微鏡でみると，丸い大きな神経節ニューロンがすでに神経突起を伸展させており，小形の細胞はシュワン細胞と線維芽細胞からなっている．シュワン細胞を含む初代混合培養系は以上の通りであるが，シュワン細胞の純培養を得るためには引き続き以下に記すcomplement-mediated cell lysisを行って，混在する線維芽細胞を除去する．

９．ペトリ皿に付着し残っている細胞を10 cmペトリ皿あたり5 mlの0.05%トリプシン-1mM EDTA液で37oC，10分間保温，0.5 ml FBSを加えてトリプシンを不活化したのち細胞をはがし，1,000回転5分遠心し細胞を集める．細胞を抗マウスThy-1.2抗体（F7D5, Serotec #MCA02; 1,000倍希釈）を含む培養液1 mlに再浮遊させ，30分氷上静置したのち，遠心し細胞を集め上清を捨てる．さらにこの細胞をウサギ補体（Cappel #55866; 10倍希釈）を含むDMEM 1 mlに再浮遊させ, 37oC，45分保温後，遠心し細胞を集め上清を捨てる．細胞を培養液に再浮遊し，新しい10 cm Poly-L-lysine塗布ペトリ皿にまいて培養を継続する．以上の操作を２日おいて２回以上繰り返すことにより，細胞膜にThy1.2抗原を発現している線維芽細胞のほとんどはcell lysisにより姿を消す．また，神経節ニューロンもそのほとんどが上記培養操作により３週間以内に消失し，結果的に95%以上純粋なシュワン細胞の培養系を得ることができる．

 

参考文献

1. Watabe K, et al. Transfection and stable transformation of adult mouse Schwann cells with SV-40 large T antigen gene.  J Neuropathol Exp Neurol 1990; 49: 455-467.

2. Watabe K, et al. Mitogenic effects of platelet-derived growth factor, fibroblast growth factor, transforming growth factor-b, and heparin-binding serum factor for adult mouse Schwann cells. J Neurosci Res 1994; 39: 525-534.

3. Watabe K, et al. Spontaneously immortalized adult mouse Schwann cells secrete autocrine and paracrine growth-promoting activities. J Neurosci Res 1995; 41: 279-290.

4. Watabe K, et al. Establishment and characterization of immortalized Schwann cells from murine model of Niemann-Pick disease type C (spm/spm). J Peripher Nerv Syst 2001;6:85-94.

5. Shen J-S, Watabe K, et al. Establishment and characterization of spontaneously immortalized Schwann cells from murine model of globoid cell leukodystrophy (Twitcher). J Neurosci Res 2002; 68: 588-594.

6. Watabe K, et al. Tissue culture methods to study neurological disorders: Establishment of immortalized Schwann cells from murine disease models. Neuropathology 2003; 23:64-74.